Cell Metabolism | 巨噬细胞与成纤维细胞间的烟酰胺代谢博弈调控胃癌微环境

近期在Cell Metabolism上发表题为“Nicotinamide metabolism face-off between macrophages and fibroblasts manipulates the microenvironment in gastric cancer”的研究。研究发现，胃癌中巨噬细胞与成纤维细胞通过NAM代谢途径的相互作用，动态调控了CD8+T细胞的细胞毒性，从而影响肿瘤微环境。特别是，巨噬细胞来源的细胞外囊泡（EVs）通过SIRT1/NICD信号轴抑制成纤维细胞中的NNMT表达，恢复了CD8+T细胞的抗肿瘤能力，并提升了抗PD-1治疗的效果。

①提出"代谢博弈"机制：通过评估NAM代谢在巨噬细胞和CAF中的激活，揭示GC肿瘤微环境（TME）中的独特"代谢博弈"机制，能够操控CD8+ T细胞的抗肿瘤反应。

②NAMPT和NNMT的双重角色：发现NAMPT在巨噬细胞中促进M1极化并恢复T细胞功能，而NNMT在CAF中表现出免疫抑制效应。

③细胞间代谢交流的机制：巨噬细胞通过分泌含有NAMPT的EV干扰CAF中的NAM代谢，并通过SIRT1诱导NICD去乙酰化，实现细胞间的代谢交流。

④NAM/MNAM比率作为生物标志物：提出NAM/MNAM比率作为实时反映代谢交流的代谢标志物，特别是在ICB反应中具有潜在应用价值。

⑤工程化外泌体在抗肿瘤治疗中的应用：通过动物实验展示体外修饰的巨噬细胞来源的EV在抑制肿瘤生长和推动有利的抗肿瘤代谢状态方面的成功应用。

⑥代谢失衡与免疫抑制：发现非响应患者中NNMT+ CAF的比例增加，导致代谢失衡和免疫抑制的TME。

⑦未来治疗潜力：提出代谢基础的组合疗法，如与抗PD-1疗法联合使用NAMPT-含有的EV，有望显著改善GC治疗效果。

通过对亚洲癌症研究小组（ACRG）队列等进行分析，发现烟酰胺（NAM）和 1-甲基烟酰胺（MNAM）这两种代谢物在胃癌预后中意义相反【NAM 与更好的预后相关，而 MNAM 与较差的预后相关】。考虑到 NAM 代谢与 TME 之间的潜在关系，进一步验证了 NAM 代谢物在 ICB 反应中的临床意义。有趣的是，在 ICB 前后患者的配对样本中，PR 患者的 NAM/MNAM 比率高于基线水平，但 SD/PD 患者的 NAM/MNAM 比率降低。这些数据表明：血浆 NAM/MNAM 比值与免疫检查点阻断（ICB）治疗反应相关，在多种癌症中具有相似临床价值，可作为 ICB 反应的指标。

图1 烟酰胺代谢在胃癌免疫治疗中的双重意义

代谢物是表征代谢反应活性的下游效应物。作为共享底物，NAM 可以被 NAM N-甲基转移酶 (NNMT) 催化，也可以通过 NAM 磷酸核糖基转移酶 (NAMPT)进入 NAD +挽救途径。NAMPT和NNMT作为烟酰胺代谢的关键酶，具有相反的预后意义和肿瘤微环境特征。

免疫细胞是 TME 的主要调节剂。为了确定影响 NAM 代谢的关键细胞类型，对接受 ICB 的患者的 19 个 GC 组织样本进行了 scRNA-seq 分析。无反应者（SD/PD）的成纤维细胞比反应者（PR）的成纤维细胞更丰富，而 PR 患者的巨噬细胞更丰富（图 2 D）。具体而言，NAMPT 在巨噬细胞中的表达高，而在 PD 患者中则明显较低（图 2 E）。相比之下，NNMT 表达仅限于成纤维细胞，在 SD/PD 患者中表达更高（图 2 F）。此外，GC 组织切片的相关性和共定位分析证实，NAMPT 信号与巨噬细胞标志物 CD68 信号重叠，NNMT 信号与成纤维细胞标志物 αSMA 重叠（图 2 G-H）。这些数据表明，巨噬细胞高表达 NAMPT，成纤维细胞高表达 NNMT。巨噬细胞和成纤维细胞中代谢酶 NAMPT 和 NNMT 的具体表达与 ICB 疗效相关。

图 2 巨噬细胞和成纤维细胞主导胃癌中的烟酰胺代谢

NAD ⁺代谢（其中 NAMPT 是限速酶）指导巨噬细胞炎症表型的维持和促炎细胞因子的产生。在人外周血来源的巨噬细胞中过表达 NAMPT，观察到 M1 巨噬细胞（标记 CD86）增加而 M2 巨噬细胞（标记 CD206）减少，而这种现象可以通过 NAMPT 抑制剂 FK866 逆转（图 3 A）。在小鼠皮下肿瘤分离的 CAF（m-CAF）中过表达 NNMT 会上调免疫抑制分子（Vimentin、Vegfa、Il10和Tgfb1）的表达（图 3 B）。这些结果表明 NAMPT 促进巨噬细胞的 M1 极化并发挥抗肿瘤作用，而 NNMT ⁺ CAFs 则表现出促肿瘤表型。

为了阐明巨噬细胞和成纤维细胞是否通过 NAM 代谢相互作用，建立了双向共培养系统。与 m-CAFs 共培养的 BMDM 中未观察到 NAMPT 表达变化（图 3C）。随后，反转了接种位置，发现与巨噬细胞共培养显著抑制了 m-CAFs 中的 NNMT 表达（图 3D）。因此推测巨噬细胞在代谢对抗中起主导作用，并通过 NAMPT 信号干扰 CAFs 中的 NNMT 表达。

为了验证 EV 是否是参与串扰的介质，首先将巨噬细胞培养上清液分离成囊泡（EV/EV ⁺）和非囊泡（EV ⁻）。观察到 EV/EV ⁺ 下调了 NNMT 表达。免疫荧光 (IF)显示了 NAMPT 与巨噬细胞中的 EV 标志物 CD63 共定位（图 3 E）。这些结果表明巨噬细胞中的 NAMPT 可以通过基于 EV 的机制抑制 CAF 中的 NNMT 表达。

为了确认 EVs 影响 CAFs 的功能，将 CAFs 与 BMDMs 共培养或用 BMDM 衍生的 EVs 处理。随着 EV 浓度的增加，CAFs 中的 NNMT 表达逐渐降低。EV 处理也抑制了 MFC 中 EMT 标志物的表达。更重要的是，BMDM 衍生的 EV 增加了 NAMPT 水平并降低了 CAFs 中的 NNMT 表达（图 3 G）。这些数据共同表明，巨噬细胞分泌的含 NAMPT 的 EV 是抑制 CAFs 中 NNMT 表达的 NAM 代谢串扰的核心介质。

最后，为了验证含 NAMPT 的 EVs在体内的抗肿瘤作用，使用小鼠 GC 细胞系 YTN-16 产生皮下肿瘤；氯膦酸盐脂质体 (Clo) 被用于特异性地去除和消除内源性巨噬细胞的作用（图 3 H）。自体注射 BMDM 或 BMDM 衍生的 EVs 后肿瘤生长受到显着抑制（图 3 I-J）。值得注意的是，用 NAMPT 过表达的 BMDM 或 EVs 治疗导致小鼠血浆 NAM/MNAM 比率显着增加（图 3 K）。由于 CD8 ⁺ T 细胞是负责肿瘤杀伤作用的主要细胞，进一步评估了CD8 ⁺ T 细胞群。用NAMPT 过表达的 BMDM 或 EV 治疗会增加 T 细胞中GZMB 和 IFN-γ 的水平（图 3 L）。总体而言，巨噬细胞及其分泌的含有 NAMPT 的 EV 可以破坏 CAF 中的 NAM 代谢，并在体内中产生有利的 CD8 ⁺ T 细胞介导的 TME 。

图 3 巨噬细胞衍生的 NAMPT EV 介导烟酰胺代谢与 CAF 的串扰

对 40 个 GC 患者的组织切片进行了 IF，CD8 细胞密度与 NAMPT 和 CD68 的表达呈正相关，但与 NNMT 和 αSMA 的表达呈负相关（图 4 A-B）。用不同比例（巨噬细胞：CAF = 1:3 或 3:1）CAF 和巨噬细胞的混合物刺激CD8 + T 细胞。当巨噬细胞比例更高或 NAMPT 水平更高时，T 细胞会转向活性表型（图4C），从而减弱了 CAF 的抑制作用。T 细胞上清的 NAM/MNAM 比率也升高了（图 4D）。如上所述，巨噬细胞通过 EVs 主导与 CAFs 的代谢串扰。此外 ，CAFs 显着降低了 CD8 + T 细胞的细胞毒性，但增加 EVs 浓度会恢复 CD8 + T 细胞活性（图 4E）。这些结果表明巨噬细胞衍生的 EV 可以逆转CAF 诱导的 CD8 + T 细胞功能障碍。

接下来，研究了 CAF 如何通过 NAM 代谢导致 T 细胞功能障碍。外源性 MNAM 治疗或 CAF 共培养减弱了 CD8 + T 细胞的细胞毒性，这种影响很大程度上依赖于 NNMT 表达或活性（图 4 F-G）。这表明表达 NNMT 的 CAF 通过代谢物 MNAM 抑制 T 细胞功能。进一步研究了 NAM/MNAM 比率是否足以影响 T 细胞功能。NAM 和 MNAM 的添加也以剂量依赖性方式改变了 T 细胞功能（图 4 H），这表明巨噬细胞和 CAF 通过 NAM 代谢串扰动态调节 CD8 ⁺ T 细胞功能。这些数据表明：巨噬细胞来源的 EVs 可逆转 CAFs 诱导的 CD8+ T 细胞功能损伤，NNMT 表达的 CAFs 通过代谢物 MNAM 抑制 T 细胞功能，影响 NF - κB 激活。

图 4 巨噬细胞和 CAFs 之间的烟酰胺代谢串扰调节 CD8 ⁺ T 细胞的细胞毒性

在 GC 中，NNMT 高表达组中 NOTCH、WNT 和 HIPPO 通路显著上调（图 5 A），其中 NOTCH 通路激活的基因与 NNMT 表达的相关性比 WNT 和 HIPPO 通路中的基因更强（图 5 B）。此外，WNT 激动剂和 HIPPO 抑制剂均不影响 NNMT 表达。因此，认为 NOTCH 通路可能与 NNMT 表达有关。

观察到过表达 NOTCH 通路转录因子 RBP-J 会上调 NNMT 以及 NOTCH 通路靶基因（HES1和HEY1）的表达，而用 RBP-J 抑制剂 RIN1 治疗会逆转 NNMT的表达（图5C）。此外，两个位点（site3，-1,471∼-1,462 bp；site5，-300∼-291 bp）在anti-RBP-J pull-down分析中富集，表明RBP-J 可以直接与NNMT启动子区结合（图5 E）。随后的荧光素酶报告基因检测证实两个位点均能够激活NNMT 转录（图5 F）。这些结果表明NNMT可能是NOTCH 通路的直接靶基因。

NAMPT 上调 NAD 消耗酶 SIRT 家族，从而维持 NAM 稳态。本研究发现含有 NAMPT 的 EV 抑制了 NOTCH 信号传导 (RBP-J、HEY1 和 HES1) 和 NNMT 表达。用 SIRT1 抑制剂 Selisistat 治疗可逆转 NNMT 水平的下降，这表明 EV 可能通过 SIRT1 发挥作用（图 5G）。

EV 降低了 NICD 的乙酰化，而 Selisistat 挽救了 NICD 乙酰化（图 5 H）。从机制上讲，EV 增加了 NICD 的泛素化，从而增加了其蛋白酶体降解，从而影响了 NICD 蛋白的稳定性（图 5 I）。进一步突变了 14 个赖氨酸残基，这些赖氨酸残基是 NICD 中的乙酰化位点，以阻断其乙酰化。将突变质粒转染到 CAF 中可消除 NICD 的乙酰化，并且 NNMT 表达对EV 处理具有抗性（图 5 J）。这些结果表明 EV 加速了 SIRT1 介导的 NICD 去乙酰化，从而降低了 CAF 中的蛋白质水平。最后，EV 对 CAF 代谢的破坏最终影响了 CD8 + T 细胞的细胞毒性（图 5 K）。这些结果表明，NOTCH 通路与 NNMT 表达相关，RBP-J 可直接结合 NNMT 启动子区域激活其转录。含 NAMPT 的 EVs 通过激活 SIRT1，促进 NICD 去乙酰化和泛素化降解，降低其核表达，进而抑制 NNMT 的转录激活。

图 5 含有 NAMPT 的 EV 通过 SIRT1 依赖的 NICD 去乙酰化抑制 CAF 中的 NNMT 表达

进行了体内实验，以评估含 NAMPT 的 EVs 与抗 PD-1 + CT 联合使用的疗效（图6 A）。自体注射 BMDM 衍生的 EVs 后，肿瘤生长受到抑制（图 6 B-C）。NAMPT 过表达 EVs 组的 T 细胞浸润和活性最高，这表明含 NAMPT 的 EVs 可以作为消除肿瘤的有力工具（图 6 D-F）。体内实验表明，含 NAMPT 的 EVs 联合抗 PD - 1 和化疗，能够抑制肿瘤生长，增加 T 细胞浸润和活性，降低肿瘤中 NNMT 水平，提高 NAM/MNAM 比值，从而恢复胃癌对抗 PD - 1 治疗的敏感性。

图 6 含 NAMPT 的 EV 重塑 TIME 并增强 GC 中的抗 PD-1 反应

原文链接：http://www.cell.com/cell-metabolism/fulltext/S1550-4131(24)00189-X