单细胞之轨迹分析（Monocle2）怎么分析？怎么用？

拟时序是一种用于单细胞转录组测序数据轨迹分析的分析工具，旨在通过构建细胞间的变化轨迹来重塑细胞随时间的变化过程。这种方法并不依赖于真实的时间，而是通过虚拟的时间（即拟时间）来描述细胞之间的转化和演替顺序。

在拟时序分析中，通常会根据每个细胞的基因表达模式，将细胞按照其发育轨迹进行排序，从而揭示细胞的异质性、功能以及发育过程。这种方法广泛应用于发育研究、干细胞分化以及肿瘤微环境免疫细胞的动态变化研究等领域。常见的分析工具有monocle2、monocle3、RNA velocity细胞速率、CytoTRACE细胞分化潜能、PAGA轨迹推断等。

Monocle2是拟时序分析的经典工具之一，它可以帮助研究者分析单细胞RNA-Seq数据，研究细胞的发育轨迹、分化状态和转录调控特征。

• 细胞类型或细胞亚型注释完成之后，就可以进行拟时序分析啦~

• 在进行拟时序分析时，首先需要选择感兴趣的细胞亚群，并分析这些亚群之间的分化关系。通过这种方法，可以构建出细胞谱系发育的虚拟时间线，即所谓的“拟时间”~

• 在进行拟时序分析（Monocle2）时，1）可依据细胞亚群潜在的分化关系，确定细胞分化起点，如在CD8 T 细胞亚群中以“naïve CD8 T”为起点进行拟时序分析；2）也可以依据分组关系对某一个细胞亚群进行拟时序分析，如对小胶质细胞亚群 Micro-2进行拟时序分析，依据疾病进展（从Control 到 Obesity再到 Diabetes），确定“Control ”为起始点进行分析~

• 当然，也可以通过 RNA velocity 、CytoTRACE 等分析工具辅助判定分化起点~

• 获得细胞分化轨迹（分化分支/cell fate）后，可依据分化轨迹，进一步分析在特定分化轨迹下显著性变化的基因（上调或下调）、基因表达模块以及对应的功能，从而解析分化轨迹及其生物学功能。

注：“抛砖引玉”的见解，希望对您的研究有所帮助啦~

文章题目：Spatially resolved multi-omics single-cell analyses inform mechanisms of immune dysfunction in pancreatic cancer

发表期刊：Gastroenterology

发表时间：2023年

文章结论：由于胰腺导管腺癌(PDAC) 仍然难以通过治疗干预，包括对免疫疗法反应不佳，因此迫切需要更细致地了解 PDAC 中的免疫微环境。该研究提供了PDAC免疫景观的空间解析精细图。证实了CD8 T 细胞的耗竭表型和髓系细胞的免疫抑制特征，并强调了 PDAC 中可能未被充分重视的免疫亚群，这些亚群与相邻正常区域内的免疫群体不同，尤其是终末耗竭并获得调节表型的 CD4 T细胞亚群和自然杀伤 T 细胞肺腺癌的免疫表型进行差异分析，发现 PDAC 中存在异常的免疫抑制亚型，及独特的免疫检查点。

拟时序分析：对 CD8 T 细胞亚群进行拟时序分析，以“naïve CD8 T”为起点, 而“CD8 Tex, CD8 Teff-IFNG, CD8 Teff-GZMK” 等处于2个不同分支的终点。沿着这两条分化轨迹，耗竭和免疫相关基因上调，而毒性基因下调。表明PDAC 中 CD8 T 细胞逐渐获得耗竭表型。

文章题目：A single-cell transcriptional atlas reveals resident progenitor cell niche functions in TMJ disc development and injury

发表期刊：Nat Commun

发表时间：2023年

文章结论：颞下颌关节盘的生物学特性涉及复杂的细胞网络，以调节颌骨功能。对不同出生后阶段小鼠椎间盘进行了单细胞转录组分析，发现成纤维细胞群可以分为软骨细胞簇和非软骨细胞簇。还发现常驻壁细胞群是椎间盘祖细胞的来源，其特征是 NOTCH3 和 THY1 信号通路被激活。此外，Myh11+壁细胞在椎间盘损伤期间协调血管生成，但失去了其祖细胞特征，最终成为Sfrp2 +非软骨成纤维细胞。

拟时序分析：对壁细胞亚群（MC1-6）进行轨迹分析，以MC1为细胞分化起始位点，分别分析了 cell fate1 和 cell fate2 这2个分化状态过程中显著性变化的基因，揭示这些基因在决定细胞分化命运过程中发挥着重要作用。

文章题目：Region-specific transcriptomic responses to obesity and diabetes in macaque hypothalamus

发表期刊：Cell Metab

发表时间：2024年

文章结论：下丘脑在肥胖和糖尿病中起着至关重要的作用。该研究分析了肥胖和散发性 2 型糖尿病恒河猴下丘脑的单细胞和空间转录组，揭示了灵长类动物特有的细胞簇、基因空间分布、细胞类型等。研究表明Infundibular (INF) 和paraventricular nuclei (PVN) 最容易受代谢紊乱影响，而 PVN 对糖尿病更敏感。在 INF 中，肥胖会导致突触可塑性和能量感应能力下降，而糖尿病会导致tanycytic 屏障受损、小胶质细胞激活和神经元炎症反应等。在 PVN 中，糖尿病恒河猴的细胞代谢和神经活动被抑制。空间转录组显示：糖尿病患者的小胶质细胞更倾向于进入parenchyma。

拟时序分析：对小胶质细胞亚群 Micro-2进行拟时序分析，依据疾病进展（从Control 到 Obesity再到 Diabetes），筛选到3个基因表达模块（分别对应 E图的绿色、红色、蓝色），这3个基因表达模块分别参与不同的信号通路/生物学过程。揭示这些信号通路可能在疾病进展过程中发挥着关键的调控作用。

参考文献

【1】Yousuf S, et al. Spatially Resolved Multi-Omics Single-Cell Analyses Inform Mechanisms of Immune Dysfunction in Pancreatic Cancer. Gastroenterology. 2023 Oct;165(4):891-908.e14. PMID: 37263303.

【2】Bi R, et al. A single-cell transcriptional atlas reveals resident progenitor cell niche functions in TMJ disc development and injury. Nat Commun. 2023 Feb 14;14(1):830. PMID: 36788226.

【3】Lei Y, et al. Region-specific transcriptomic responses to obesity and diabetes in macaque hypothalamus. Cell Metab. 2024 Feb 6;36(2):438-453.e6. PMID: 38325338.