干货 | CAR结构与设计

嵌合抗原受体（CAR）是一种合成的细胞表面受体，与T细胞的传统激活方式不同，CAR激活T细胞通常不需要经过抗原提呈细胞使MHC-肽段和T细胞表面抗原结合，而直接激活T细胞。CAR-T细胞疗法是对T细胞进行基因修饰以表达肿瘤特异性受体，使T细胞在回输到患者体内后产生肿瘤特异性的免疫反应。CAR通常由四个结构域组成:细胞外抗原结合结构域、间隔区或铰链区、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域（图1）。

图1 CAR的结构分解图^[1]

细胞外结构域包括抗原结合域和铰链区（Hinge）两部分。抗原结合域是CAR-T细胞治疗中CAR分子的关键组成部分，它负责识别肿瘤细胞表面的特定抗原，直接决定了CAR-T细胞对肿瘤细胞的识别能力。这个结构域通常是一个抗体衍生的单链可变片段（scFv），其中可变轻链（VL）和可变重链（VH）通过多肽连接而成。有时可以使用一种可以与靶细胞上的受体结合的天然蛋白质或肽代替scFv，重链上的单变量结构域（VHH），也被称为纳米抗体，也被用作CAR的靶向结构域。VHH来源于仅重链抗体(HCAB)的可变结构域。与传统scFv相比，VHH识别和结合具有相似的结合能力和特异性，以及溶解度和稳定性的靶抗原^[2]。

铰链区位于抗原识别结构域（如scFv）和跨膜结构域之间，连接scFv（单链可变片段）和跨膜结构域，铰链区通常来源于CD8、CD28或IgG。为CAR分子提供必要的灵活性，使抗原结合域能够适应不同的空间位置和接近肿瘤细胞表面的抗原表位。铰链区的长度和组成可以影响CAR-T细胞的激活状态。通过调整铰链区的长度，可以使CAR-T细胞与靶细胞之间保持最佳的距离，增强CAR与肿瘤抗原的亲和力。

跨膜结构域将嵌合抗原受体（CAR）锚定在T细胞膜上确保抗原结合域能够与肿瘤细胞表面的抗原有效结合。

跨膜结构域通常来源于天然蛋白质，如CD3ζ、CD4、CD8α。然而，由于CD3ζ跨膜结构域可以不需要与内源TCR结合即可高度活化T细胞，这种强烈的激活可能导致T细胞的过度激活和耗竭，因此，在设计CAR分子时，研究人员可能会选择其他跨膜结构域，如CD8α或CD28，以平衡CAR-T细胞的激活和稳定，它们可以通过内源性的原蛋白跨膜结合来影响CARs之间的分子相互作用，形成同型二聚体或三聚体^[3]来参与CAR的其他功能，如稳定性和与其他膜蛋白的相互作用，细胞内信号域参与免疫细胞的信号转导和激活。CD3ζ跨膜结构域还可以与内源性T细胞受体（TCR）形成异二聚体，CD8α或CD28跨膜结构域可以增强CAR在T细胞表面的表达和稳定性。

共刺激分子的跨膜结构域并不直接与配体结合，而是通过其胞内结构域与T细胞内的信号传导途径相结合。

共刺激结构域，如CD28和4-1BB，在激活过程中通过其胞内结构域中的特定基序（如免疫受体酪氨酸激活基序，ITAM）来传递信号。当CAR的抗原结合域与目标抗原结合后，这个共刺激分子的胞内部分就会启动信号传导，通过PI3K/AKT、TNF受体相关因子2 (TRAF2)/p38MAPK 和 JNK等通路，加强T细胞的激活和扩增。这些信号转导过程最终汇聚在关键的转录调节因子上，如NF-κB、NFAT、STAT3、JUN 和 FOS，引起与T细胞激活和效应功能相关的基因表达变化。从而促进T细胞的激活、增殖和分化。

CD28会导致快速扩张，但持久性较差，而4-1BB的存在使CAR的扩增速度较慢，但持久性较长。含有CD28的CAR-T细胞表现出更类似效应物的记忆表型，并增强糖酵解代谢。CD28共刺激通路在CAR-T细胞中被快速激活，可能导致早发性细胞因子释放综合征（CRS），最终导致多器官衰竭^[4]。

另外，4-1BB的T细胞可以增强线粒体活性，成为更像中枢记忆的T细胞，呼吸代谢和脂肪酸代谢增加。4-1BB CAR可在配体结合后激活(NF-кB)信号，并依赖于肿瘤坏死因子(TNF)受体相关因子(TRAFs)。TRAFs通过调节NF-KB影响细胞的活力、增殖和细胞毒性^[5]。

CD3-ζ (CD247)是最远端的胞内部分，是一个具有三个基于酪氨酸的免疫受体激活基序（ITAMs）的信号区^[6]。当CAR的抗原结合域与肿瘤细胞表面的抗原结合后，CD3ζ的ITAMs会招募并激活下游的蛋白激酶，如ZAP-70，进而激活T细胞。

CAR-T细胞发挥作用时，信号首先传导到CD3ζ链的胞内信号转导域。当CAR的抗原识别结构域与肿瘤细胞表面的抗原结合后，会触发CD3ζ的免疫受体酪氨酸激活基序（ITAMs）发生磷酸化。这一磷酸化过程会招募并激活ζ链相关蛋白激酶70 (ZAP-70) 的信号转导^[7]，从而促进下游接头蛋白和支架蛋白的组装，激活T细胞反应（增殖、细胞因子释放等）。

在第三代CAR-T细胞中，跨膜结构域和CD3ζ之间隔着两个共刺激结构域，这种设计可以增强信号传导的强度和质量，调节T细胞的代谢状态和功能，提高疗效和持久性。通过这种协同作用，CAR-T细胞被激活并发挥其抗肿瘤的免疫功能。

参考文献